【全球独家】空间代谢组学研究胶质母细胞瘤患者的药代动力学和药效学图谱-- 迪族网

【全球独家】空间代谢组学研究胶质母细胞瘤患者的药代动力学和药效学图谱

来源：欧易生物　2022-10-17 15:37:29

前言

GBM的一个常见遗传特征是表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达。EGFR基因扩增发生在约40%的GBM中，几乎一半的这些肿瘤具有额外的截断或点突变，导致配体非依赖性、高水平的组成性信号。EGFR信号传导失调促进细胞增殖、迁移、侵袭性。厄洛替尼是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂，FDA批准用于治疗非小细胞肺癌，在具有EGFR激酶域激活突变的腺癌中具有显著活性。基于EGFR信号的激活频率和重要性，在GBM中评估各种EGFR抑制剂一直是人们关注的焦点。

药代动力学（PK）研究中，患者脑脊液（CSF）中测得的厄洛替尼浓度与临床前研究中的有效浓度相似；然而，关于厄洛替尼的脑脊液浓度与厄洛替尼在人脑和肿瘤组织中分布的浓度和异质性的关系，我们知之甚少。在临床前模型中，厄洛替尼在正常小鼠脑中的分布有限，在对新诊断或复发的GBM患者进行厄洛替尼测试的临床试验中仅观察到边缘活性。在胶质瘤侵袭区发现的限制厄洛替尼在完整BBB中渗透性的主动外排机制可能是导致缺乏足够递送的部分原因，从而导致GBM的疗效。因此，本文报告的研究提供了一个“失败分析”，以了解厄洛替尼肿瘤分布的局限性，并描述了一个多模式平台，该平台可用于评估和提名最有希望的药物用于GBM临床试验的评估。

(资料图片)

本文由麻省理工学院科赫研究所、美国梅奥诊所、美国布里格姆女子医院等联合学院及机构的Kristina B Emdal、Shiv K Gupta、 Forest M White、Walid M Abdelmoula为共同通讯作者在Nature Communication（IF:17.694）发表了题为“Integrated mapping of pharmacokinetics and pharmacodynamics in a patient-derived xenograft model of glioblastoma”的研究成果，将补充分析应用于胶质母细胞瘤患者衍生的异种移植模型，以定量绘制分布图和由此产生的对EGFR抑制剂厄洛替尼的细胞反应。将厄洛替尼的空间代谢组图像与组织学和核磁共振图像配准，以将药物分布与肿瘤特征相关联。磷酸化蛋白质组学和免疫组化用于评估药物反应中的蛋白质信号，并通过mRNA测序与转录反应整合。该综合数据集提供了对药代动力学和药效学的同时洞察，并表明厄洛替尼递送至颅内肿瘤不足以抑制EGFR酪氨酸激酶信号。

研究思路

研究结果

1、集成PK和PD的多模态分析

本研究旨在研究EGFR抑制剂厄洛替尼在侧翼和IC-GBM-PDX模型中的分布和细胞反应，如图1所示。侧翼组和IC组的小鼠均服用安慰剂，IC组以低剂量（33 mg/kg）和高剂量（100mg/kg）厄洛替尼治疗，侧翼组以超低剂量（5mg/kg) 、低剂量（33 mg/kg）和高剂量（100mg/kg）厄洛替尼治疗。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定血浆、脑和侧翼肿瘤中的药物水平。然后对组织样本进行连续切片和处理，以进行多模态成像。对一只高剂量IC-PDX动物的组织进行详细分析（MRI、3D空间代谢组学、组织学、SRS显微镜和mRNA测序），以提供综合PK和PD的比较数据。在不同剂量的厄洛替尼下，对具有侧翼和IC PDX的动物的组织进行进一步分析，以研究剂量依赖性反应以及药物递送和分布的差异。

图1 | 用于调查药物递送和反应的多模式分析工作流程示意图

将两组小鼠注射患者诱导的GBM12肿瘤细胞，以在侧翼或大脑中建立异种移植物。两组小鼠均接受安慰剂、超低剂量（5mg/kg）低剂量（33mg/kg）或高剂量（100 mg/kg）厄洛替尼。

2、空间代谢组学观察到的异质性药物分布

如图2a、b所示，运用空间代谢组学连续切片与H&E染色进行比较。m/z 394.1760的离子图像（图2b）表明，与正常脑实质相比，厄洛替尼在高细胞肿瘤区域的分布强度更高。药物不是均匀分布在肿瘤中，而是在x、y和z维度上以不同的强度出现。

厄洛替尼和代谢物表现出不同的分布，代谢产物比母体药物分布更广，在侧脑室中检测到相对较高的浓度（图2c）。通过计算离子图像对之间的皮尔逊相关系数（对于整个三维数据集），测量不同离子之间的共定位。在母体药物和药物代谢物之间观察到最高的共定位，母体药物和代谢物与肿瘤生物标记物显示出相似的共定位性，表明对靶区具有相似的特异性。

图2 | 使用空间代谢组学、MRI和H&E的多模式3D成像

字母“L”和“R”表示小鼠大脑的左侧和右侧。

3、MRI与空间代谢组学的对比分析

在图2d中可以看到药物和T2W MR图像之间的重叠图像。药物离子图像和H&E组织学之间的配准揭示了肿瘤区域内药物分布的异质性程度。T1Gd和T2W MR图像中的高对比度区域相似（图2d）。如使用从T1Gd MR和厄洛替尼图像分割的三个不同感兴趣区域（ROI）的掩模图像测量的，MR图像中高对比度区域内的药物信号强度最高（图2d，e）。肿瘤侵袭边缘（MR图像的对比增强区域以外）厄洛替尼的低强度表明肿瘤细胞的显著部分暴露不足（图2d）。综上所述，这些数据表明厄洛替尼药物水平升高，但在肿瘤内高度可变。

4、SRS显微镜的高分辨率成像

由于高度堆积的癌细胞体，在肿瘤核心中检测到较高水平的蛋白质（图3b-e）。在脑/肿瘤边界，观察到肿瘤边缘有髓轴突纤维的压缩或重组以及癌细胞侵入正常脑组织（图3f-g）。在正常大脑结构中，由于脂质/蛋白质浓度差异，白质（高脂含量，绿色）和灰质（高蛋白含量，蓝色）得以区分（图3h-i）。连续切片的相应H&E图像（图3c-i）表明SRS成像能够提供标准组织学无法提供的详细空间和化学信息。

厄洛替尼空间代谢组学和SRS图像的重叠、共同配准图像为研究药物分布及其与脑组织结构、形态和化学成分的相关性提供了一种手段（图3d-h）。图像显示富含蛋白质的肿瘤核心含有较高浓度的药物。在肿瘤边缘（图3f），观察到与较高的脂质含量（绿色）和较低的药物含量（粉红色）呈反比关系。在第三脑室中检测到一个小的、高度定位的高药物浓度区域（粉红色）（图3h）。

总之，这些初步表明，厄洛替尼可以进入肿瘤核心，但在正常大脑区域内、肿瘤浸润边缘和肿瘤与白质之间的界面处，通过完整的BBB的扩散有限。

图3 | 药物（厄洛替尼）分布的相关空间代谢组学成像和脑组织形态学的SRS成像

5、药物递送在侵袭性肿瘤边缘受到限制

剂量为33和100 mg/kg的IC-PDX中厄洛替尼的平均浓度发现1个相似，在给药33 mg/kg的肿瘤中检测到的浓度略高（表1）。这可能是由于在33 mg/kg的剂量下，靠近大脑表面的肿瘤血管化相对较好。进一步将IC肿瘤分割为核心和侵袭边缘，发现边缘处的药物浓度相对于肿瘤核心（100mg/kg）降低了约两倍。在侧翼肿瘤核心和边缘之间未观察到药物浓度差异。厄洛替尼在IC肿瘤中的浓度在33和100 mg/kg剂量下相似、侧翼肿瘤中厄洛替尼的平均浓度呈剂量依赖性，分别为2426.8和8211.6 ng/g。

总的来说，与侧腹相比，在 IC 肿瘤中观察到药物和血红素之间的相关性更高，这表明药物无论相对浓度如何，在 IC 肿瘤中的可利用性较低。在IC肿瘤边缘，药物与血红素之间的相关性也高于相应的肿瘤核心。

表1 | 通过空间代谢组和LC-MS/MS探究不同剂量的指标比较

在接受低剂量（33 mg/kg）和高剂量（100mg/kg)厄洛替尼治疗的动物的IC和侧翼肿瘤以及正常脑、全脑和荷瘤脑中测量的厄洛替尼的组织与血浆比率和浓度的比较

6、相对于侧翼，IC肿瘤中厄洛替尼活性降低

安慰剂与低剂量或高剂量厄洛替尼治疗之间IC肿瘤区域的总EGFR无显著差异。然而，在侧翼肿瘤中，与安慰剂相比，高剂量厄洛替尼治疗后总EGFR的量减少。在p-EGFR的相对水平上观察到侧翼和IC肿瘤之间的相似关系；用100mg/kg厄洛替尼治疗的IC肿瘤中与安慰剂相比p-EGFR没有变化，然而，在所有IC肿瘤中都观察到信号强度的异质性。低剂量和高剂量厄洛替尼治疗相对于安慰剂，在侧翼肿瘤中的p-EGFR降低。这一结果与剂量-反应关系一致，其中，与侧翼肿瘤相比，IC肿瘤中厄洛替尼的可用性较低，导致EGFR活性的抑制不足。

图4 | 脑和侧翼肿瘤中总EGFR和磷酸化EGFR（p-EGFR）的组织免疫荧光成像

7、低剂量厄洛替尼抑制侧翼EGFR

磷酸化蛋白组分析在四个治疗组（安慰剂，5、33、100 mg/kg)中鉴定了210种独特的含磷酸酪氨酸的肽。在整个肿瘤治疗条件下对这些磷酸化位点进行量化，显示了治疗前和超低剂量厄洛替尼（5mg/kg）的肿瘤间异质性（见图5）。用厄洛替尼治疗后（33和100mg/kg）对信号的抑制，导致肿瘤异质性降低。对于这些高剂量条件，作者观察到靶（EGFR）、近端衔接蛋白（Gab1、Shc1）和下游信号（MAPK1、MAPK3）的明显抑制，表明33 mg/kg是抑制侧翼肿瘤中EGFR信号传导的适当剂量。尽管治疗的异质性有所降低，但用33或100 mg/kg治疗的肿瘤厄洛替尼显示磷酸化增加，可能表明这些肿瘤中开始出现耐药途径。

图5 | 厄洛替尼治疗的侧翼肿瘤的体内磷酸化变化揭示了EGFR信号的抑制

8、侧翼和IC的剂量依赖性转录反应

与安慰剂治疗的肿瘤相比，所有厄洛替尼治疗组均激活了真核启动因子2（EIF2）、过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）、AMP激活蛋白激酶（AMPK）信号，并降低了肌动蛋白细胞骨架和Ephrin B信号。此外，Rho-GTPase活性特征降低，RhoGDI信号增加。具体而言，与安慰剂相比，厄洛替尼治疗的肿瘤中CDC42、RhoA和Rac信号传导降低。作者观察到，用5mg/kg厄洛替尼治疗不足以使EGF、肝细胞生长因子（HGF）、14-3-3、蛋白激酶A、整合素和磷脂酶C信号通路失活。与低剂量厄洛替尼的侧翼肿瘤相比，高剂量厄洛替尼激活G1/S细胞周期检查点和白细胞介素9（IL9）通路，并抑制EGF、细胞周期蛋白和死亡受体信号通路。

为了将侧翼肿瘤的药物暴露/反应结果与IC肿瘤反应相关联，使用LCM解剖IC肿瘤组织（剂量为100mg/kg厄洛替尼）分成四个单独的象限（图6b）。使用连续组织切片中药物的空间代谢组离子图像来确定所解剖的每个象限中药物的相对浓度（图6b，c）。每个象限的相对药物浓度从象限R1的100%变化到象限L1的75%，象限R2和L2分别为64.5%和61.09%。来自每个象限的转录物聚类分析显示剂量相关反应，突出IC药物分布和相关反应的异质性。在本分析中，考虑了所有基因，限制了差异基因表达。100mg/kg药物治疗的IC肿瘤中心的药物浓度是IC肿瘤边缘药物浓度的两倍并且和33mg/kg治疗的侧翼肿瘤药物浓度相似。因此，IC肿瘤的转录物与侧翼肿瘤中观察到的剂量-反应关系一致（图6d）。

图6 | 用厄洛替尼给药的动物侧翼和颅内（IC）肿瘤组织的mRNA测序显示剂量依赖性途径调节

9、整合磷酸化蛋白质组学和mRNA测序数据

通过层次聚类分析在跨肿瘤的210个酪氨酸磷酸化位点的相关矩阵中，产生了几个簇（图7a），包括簇图中间大多数磷酸化位点高度相关的大簇。这一大簇表明，尽管肿瘤间存在异质性，但大多数位点在肿瘤和治疗条件之间是共同调节的。较小的亚群在数据中也很明显，包括由四种EGFR磷酸肽组成的高度共调节位点群、近端衔接蛋白和直接EGFR底物SHC和GAB1上的磷酸化位点、ERK1和ERK2丝裂原激活激酶（MAPK3和MAPK1）上的激活环磷酸化位点以及ARHGAP35（p190RhoA）上的一个位点。重要的是，该子聚类显示了分析提取特征良好的信号网络的能力，而其他子聚类突出了已知和潜在的新信号相互作用。使用类似的基于聚类/相关性的方法来查询定量mRNAseq数据导致识别两个大的、反相关的聚类（图7b）。这些大簇主要由EGFR抑制后增加或减少的位点定义，并且由于它们对厄洛替尼的差异反应而反相关。

定量磷酸化蛋白质组学和mRNASeq结果在肿瘤中相互关联，以试图识别信号和转录的共同调节网络（图7c）。该分析主要由抑制剂处理后的折叠变化方向决定，大多数磷酸化位点和约一半转录物在厄洛替尼处理后减少；因此，发现这些位点和转录物相互关联，而另一半的mRNA数据与二者呈反相关。有趣的是，该分析还提取了特征良好的信号网络，可能是由于它们对扰动的协调响应。

如图7d所示，给定蛋白质上的磷酸化位点不一定与其各自的转录物相关；例如，随着厄洛替尼浓度的增加，EGFR、近端衔接蛋白GAB1和下游MAPK1蛋白的磷酸化都显著降低，而它们各自的转录水平要么增加（EGFR，GAB1），要么略有降低（MAPK1）。如本例所示，获取同一肿瘤的mRNA和蛋白质磷酸化数据能够确定磷酸化的变化可能是由于信号改变，而不是由于转录和翻译导致的蛋白质表达改变。

图7 | 磷酸化蛋白质组学和mRNASeq数据的综合分析

研究结论

总的来说，作者认为大部分IC-PDX肿瘤接受的药物水平不足以成功抑制EGFR酪氨酸激酶信号，这可能是由于BBB和组织特征施加的限制。这一结论是基于对厄洛替尼与其他化学和功能标志物的分布进行成像得出的，并证明了多模式平台在建立药物PK和PD之间关系方面的作用。

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