中科院团队提出DNA链交换新模型，或给已有经典模型带来变革
来源：DeepTech深科技 2023-05-05 07:24:38
【资料图】
作为一种生物学机制，同源重组几乎发生在所有的生命体系中，比如噬菌体、细菌、真菌、植物以及人类中。 多年前，遗传学家首次报道了同源重组的现象。1909 年，比利时生物学家弗朗斯·阿尔丰斯·森斯（Frans Alfons Janssens）等人提出了交叉型理论，指出同源染色体存在交叉结构的可能。 美国生物学家托马斯·亨特·摩尔根（Thomas Hunt Morgan）在建立遗传学连锁定律时，也发现同一染色体上的非等位基因并不总是连锁在一起遗传给后代。 1931 年，美国两名遗传学家哈里特·鲍德温·克赖顿（Harriet Baldwin Creighton）和芭芭拉·麦克林托克（Barbara McClintock）通过实验证明了 Janssens 的假说，并指出同源染色体的交换是非等位基因重组的物质基础。 20 世纪 40 年代中期，同源重组现象在大肠杆菌中被发现。随后的实验发现：对于 DNA 的损伤，重组缺陷的菌株呈现出异常敏感的特点。后来，人们逐渐意识到在 DNA 损伤修复的过程中，同源重组发挥着重要作用。 进一步的生化实验表明，大肠杆菌中同源重组的主要功能在于修复 DNA 的双链断裂损伤。因此，同源重组既可以通过非等位基因的重新组合，来促进遗传的多样性；又可以通过双链断裂损伤的修复，来维持基因组的稳定性。 据了解，同源重组由一系列保守的同源重组酶催化完成，包括噬菌体的 T4 UvsX、古细菌的 RadA、大肠杆菌的 RecA、以及真核生物的 Rad51 和 DMC1 等。 同源重组需要多种蛋白质的参与，并会受到精细的调控。其生物化学过程大致分为以下四个阶段：起始阶段、同源链交换阶段、新链合成阶段和分离阶段。 在起始阶段，多种解旋酶和核酸酶作用于 DNA 断裂处。这时，它们会以特异性的方式切割双链 DNA，从而产生 3’端突出的单链 DNA，并被单链 DNA 结合蛋白予以保护。 在同源链交换阶段，同源重组酶首先会在辅蛋白的帮助下，替代单链 DNA 去和蛋白进行结合，并协同组装形成核蛋白纤维丝。这时，同源重组酶能够寻找并侵入同源的双链 DNA 片段，从而与之发生链交换反应，进而形成三链连接分子。 在新链合成阶段，DNA 聚合酶会以完整的同源 DNA 链为模板，在断裂链的 3’末端合成并延伸新的 DNA 链，从而形成交叉结构。 在分离阶段，解离酶或核酸酶将交叉结构解开，形成两条独立的双链 DNA 分子。至此，同源重组得以完成。 其中，同源配对阶段是同源重组的核心步骤，其中又包括活性核蛋白纤维丝的形成、介导 DNA 链的交换反应等细分步骤。 RecA 是一种典型的同源重组酶，其已成为原核生物同源重组研究的代表。过去四十年间的研究表明，RecA 可在单链 DNA 上协同组长，形成一种刚性、拉伸且欠旋的核蛋白纤维丝结构。 其中，每三个核苷会结合一个 RecA 单体，并且所有核苷都会被 RecA 单体结合，不过 B 型 DNA 的构象会被局部保留下来。 这种对称、完美的核蛋白纤维丝结构，已被设定为介导同源重组的必须形式。同时，这一假设已经成为同源重组研究的经典模型。 在前期研究中 [1]，中科院生态环境研究中心研究员和团队，对 RecA 蛋白在单链 DNA 上的动态组装进行了系统考察。 他们发现：在生理条件下，核蛋白纤维丝中的 RecA 具有 ATP 水解活性，而 ATP 水解会导致 RecA 蛋白从单链 DNA 上解离，从而形成低密度、不饱和的核蛋白纤维丝结构，其中含有大量裸露（未结合 RecA 蛋白）的核苷酸位点。 令人惊奇的是，当这一结构位于体外时，则可以促进链交换反应的发生。而体内的间接实验也暗示，这一不饱和结构是链交换反应所必须的。 在经典模型中，RecA 蛋白在 ssDNA 上通过协同组装，可以形成饱和的核蛋白丝，并能和同源双链 DNA 进行结合。 以此为基础，饱和核蛋白丝中的 ssDNA 能和同源的双链 DNA 并齐排列，从而发生链的完全交换。 而课题组发现的不饱和核蛋白纤维丝结构，虽然也能发生有效的链交换反应，但却难以用经典模型来解释。 他表示：“可以说我们的发现是对过去经典模型的颠覆或改变。在观测到非饱和核蛋白纤维丝中存在单独的 DNA 核苷区域的同时，我们也提出了一个新的科学问题：即在生理条件下，饱和的核蛋白纤维丝结构是介导链交换反应所必须的吗？是的话，该如何维持这一结构？如果不是，核蛋白纤维丝结构中 RecA 缺失区域如何进行链交换？” 而在该团队的最新工作里，他们对这些问题进行了回答。基于实验结果，其提出一种新的、侧翼链分离依赖的 DNA 链交换模型。借此揭示了如下规律：即不饱和组装 RecA 核蛋白纤维丝，可以利用侧翼链分离活性直接介导 DNA 链交换。 研究中，他们先是利用截断的单链 DNA 作为入侵底物，在链交换过程中观测到了同源双链 DNA 中侧翼的双链分离。 “尽管这是一个非常好的开端，但是这种设计牺牲了链交换的效率，其结果也只是定性地证明了侧翼双链分离的可能性。”说。 这时面临的问题是：如何准确测量出侧翼双链分离活性，即多长的侧翼 DNA 的双链可以被有效分离？ 为了回答这一问题，他们尝试过各种设计方案，然而多数都以失败告终。 经过一番摸索，他们设计出一种短链-长链串联的单链 DNA，并以此作为入侵链底物。利用这一独特设计，课题组发现在碱基配对的辅助下，侧翼 DNA 双链分离至少可达 45bp。由此推断，侧翼双链分离是一种长程作用。 在此基础上，他们建立了双色交替激发的单分子成像方法，借此能够同时观测链的配对与分离。此外，对于碱基配对与双链分离的动力学及其能垒，课题组也开展了精细的研究。 日前，相关论文以《RecA 核蛋白丝在 DNA 链交换反应中的侧翼链分离活性》（）为题发在 Nucleic Acids Research上 [2]。FangzhiYu 是第一作者，担任通讯作者。 图 | 相关论文（来源：Nucleic Acids Research） 据了解，在过去五十多年间全球多家实验室通过生物化学、生物物理和结构生物学的手段，对链交换反应进行了研究。 但是，对这一过程中的具体机制，人们理解得依然不够全面，尤其仍旧不清楚同源重组酶到底是如何克服或拒绝异源区域的。 而团队设计的这种有趣的 DNA 底物，对于生理条件下不连续核蛋白纤维丝介导 DNA 链交换的机制的理解，可以起到一定促进作用。 表示：“我们的成果是在基础研究之上的发现，可以带来思想性的启示。距离经典链交换模型的首次面世，已三十多年的历史，并已发展成为人们思考同源重组相关的各种事件的知识基础。而我们的发现是对经典模型的改变和补充。” 由于同源重组这一反应，与癌症的发生发展以及治疗存在一定关系。由此可以推测，此次发现将有助于理解这些过程、以及助力于相关药物的发展。 另外，此次发现的侧翼链分离，或能帮助提高基因编辑的效率与准确性，尤其是提升基因敲入（knock in）的效率。 这是因为在进行基因敲入时，一个外源的 DNA 模板是必不可少的，后者会被用于基因组 DNA 定点切割后的同源重组修复。这样一来在修复过程中，外源模板携带的基因信息就会被插入基因组 DNA 中。 回顾研究全程，表示：“我们的前期发现改变了经典模型，但也因此面临传统研究的怀疑。因此当我们设计出短链-长链串联的单链 DNA 探针，由此证明了侧翼 DNA 双链分离活性的时候，那一刻格外让人难忘。这一活性的证明也从侧面支持了我们的前期发现，也会让更多科学家意识到这些发现的合理性，进而刺激新认知的产生。” 1.Cell Discov., 2017, 3: 16053; Chem. Sci., 2021, 12: 2039–2049 等 2.Yu, F., Zhang, D., Zhao, C., Zhao, Q., Jiang, G., & Wang, H. (2023). Flanking strand separation activity of RecA nucleoprotein filaments in DNA strand exchange reactions.Nucleic Acids Research,51(5), 2270-2283. 关键词：
营业执照公示信息