临床显微镜

来源：韵翔光电　2022-04-15 16:49:25

临床显微镜

我们了解临床实验室的需求与研究实验室的需求不同。虽然滤光片的成本可能只占临床显微镜花费的一小部分，但考虑到此类设备的成本来自运营预算而不是研究资助，成本可能会很沉重。在为临床实验室采购时，您必须同时考虑性能和成本。

这些性价比高的BrightLineBasic单波段滤光片组将BrightLine研究级别的经验证的、耐用的滤光片组和超过高级软镀膜性能的荧光滤光片的光学性能相结合，但以软镀膜滤光片的价格提供。事实上，相比于软镀膜的滤光片组产品，BrightLineBasic滤光片组具有可比的对比度、更亮，但不易烧坏，这进一步降低了总拥有成本。非常适合需要成本效益高、量大、“不易烧熔”的常规应用，如：临床显微镜检查（真菌和真菌染色、免疫荧光测试）、常规分析和教育。

荧光滤光片简介

一个分子吸收其吸收谱带波长范围（即吸收光谱）内的光，然后几乎瞬间发出较长的、位于其发射谱带波长范围（即发射光谱）内的光，此时，就会发生光学荧光。为了达到分析的目的，强的荧光分子，亦被称为荧光团、荧光染料，专门用于连接到生物分子或其他感兴趣的目标，用于鉴定、定量、甚至实时观察物质的生物和化学活性。荧光染料因为具有独特的灵敏度、高特异性和简单性，被广泛应用于生物技术和分析检测中。大多数荧光仪器，包括荧光显微镜，都是基于光学滤光片。

一个典型的系统有三个基本的滤光片组成：激发滤光片（或吸收滤光片），二向色镜分束镜（或二向分色镜）和发射滤光片（或阻挡滤光片）。激发滤光片通常是一个带通滤光片，它只透过荧光染料的吸收波长，从而最大限度地减少荧光的其他来源的激发光和阻挡荧光发射带内的激发光。二向色镜分束镜是一种边缘滤光片，用于斜角入射（通常是 45°），以有效地反射激发波段的光和透射发射波段的光。Semrock发射滤光片通常是一个带通滤光片，仅透过荧光染料的发射波长，并阻挡这个波段之外的所有不需要的光-尤其是激发光。通过滤光片阻挡不需要的激发能量（包括紫外和红外）或样品和系统的自发荧光，就可以得到具有黑暗背景的荧光图像。

我们可以通过选择适当的光学滤光片，组成一个滤光片组，用于观察荧光或者对荧光进行成像，这样就可以达到使一个给定的荧光染料可视化的目的。因为不同荧光染料的激发光谱和发射光谱不同，滤光片组需要优化，才可以用于不同荧光染料的同时成像。在不同的实验条件下使用同一个荧光染料时，滤光片组也需要优化。

装配滤光片镜盒

BrightLine滤光片具有极高的耐用性，您可以很容易将其安装在显微镜的滤镜盒、滑块和滤光片转轮中。为获得最佳性能，应按照正确的方向把滤光片安装到显微镜中，请参照以下图解学习滤光片在显微镜的正确安装方向：

已装配好带边框的激发片和发射片的正确安装方向

滤光片上的箭头方向与光路中光的方向一致。具体如下：激发片的箭头方向是从光源指向二向色镜，发射片的箭头方向是从二向色镜指向眼睛或相机。

二向色镜通常未装配在镜框内，也应正确安装：二向色镜有反射镀膜的一面正对激发片或光源和样品。如下图所示。

二向色镜和其他未装配的滤光片的安装方向

二向色镜和其他未装配的无边框的滤光片都有特征性的方向标记，通过这些标记，可以找出镀膜面，需要迎光照射来的方向。方向性的标记通常在滤光片的表面（光刻、开槽雕刻线、标记黑点等），或者在滤光片的侧边，标记为箭头(^)，这些标记在下图中展示，可作为对应的方向指导。

Semrock 商标:商标面正对着入射光。

刻线:在滤光片的某一面的下方有刻线，刻线的面正对着入射光。稍微倾斜一定的角度能更加容易的看清刻线。

点:在滤光片的某一面有一个小点，小点的面正对着入射光。稍微倾斜一定的角度能更加容易的看清小点。

箭头:在滤光片的侧边，标记为箭头(^)，箭头的方向就是光行进的方向。

请注意:很多滤光片都是双面镀膜的，所以区别镀膜面并无意义，关键是安装方向要正确。镀膜面对着光照射进来的方向！

无标记的滤光片如何区分方向

如果肉眼观察二向色镜，您可以看到亮物体的双反射，并明显看到此滤光片远端边缘的厚度。说明此时，反射镀膜面在滤光片的下面（如下左图所示）。

如果肉眼观察二向色镜，您可以看到亮物体的占优势的单反射，同时，此滤光片远端边缘的厚度不可见，说明此时，反射镀膜面在滤光片的上面（如下右图所示）。

如何辨别滤光片的安装方向

已装配好带边框的激发片和发射片的正确安装方向

滤光片上的箭头方向与光路中光的方向一致。具体如下：激发片的箭头方向是从光源指向二向色镜，发射片的箭头方向是从二向色镜指向眼睛或相机。

二向色镜通常未装配在镜框内，也应正确安装：二向色镜有反射镀膜的一面正对激发片或光源和样品。如下图所示。

二向色镜和其他未装配的滤光片的安装方向

Semrock 商标:商标面正对着入射光。

刻线:在滤光片的某一面的下方有刻线，刻线的面正对着入射光。稍微倾斜一定的角度能更加容易的看清刻线。

点:在滤光片的某一面有一个小点，小点的面正对着入射光。稍微倾斜一定的角度能更加容易的看清小点。

箭头:在滤光片的侧边，标记为箭头(^)，箭头的方向就是光行进的方向。

请注意:很多滤光片都是双面镀膜的，所以区别镀膜面并无意义，关键是安装方向要正确。镀膜面对着光照射进来的方向！

无标记的滤光片如何区分方向

多带滤光片组配置

在单个样品中标记多个不同的感兴趣对象的能力大大增强了荧光成像的力量。实现此类样品的高质量成像的一种方法是，在多次拍照之间切换多个单带滤光片镜盒，然后以电子方式组合这些照片。这种方法的局限性是：不同时间点上会存在多个单色图像之间的“像素位移”，以及速度慢（相对于一次采集一张完整的彩色图像）。Semrock使用BrightLine“- ZERO ”工艺解决了“像素位移”的问题。不可否认，单波段滤光片镜盒的方法仍然是最好的技术之一，可以实现图像的高对比度和减少串色的可能。但随着高速成像需求的不断增加，尤其是对使用荧光蛋白标记的活细胞进行实时成像分析时，需要一种可以替代单带滤光片组镜盒的方法，但是又不要牺牲太多的图像保真度。Semrock的多波段光学滤光片产品将多色同时成像提升到一个新的水平。

有三种类型的多带滤光片组可实现同时多色成像。

“全多带”配置

该配置的激发片，发射片和二向色镜分束镜都使用多波段滤光片，是理想的直接可视化的解决方案，适合的应用有：在样本上定位感兴趣的区域。这种方法快速且容易实现，并与所有标准的荧光显微镜兼容。然而，它需要一个电子成像的彩色相机，不能消除荧光串扰。

“Pinkel”配置

该配置使用多波段发射片和多波段的二向色镜分束镜配合多个单波段激发片。它提供了一个经济的方式来实现非常高速、高对比度、同时的多色成像。这种方法基于单色CCD相机。相对于彩色相机，单色CCD的成本较低，提供了更好的分辨率和更低噪声，带来更好的性能。虽然相对于“全多带”的方法，串扰有所减少，但由于所有发射波段同时成像，仍然可能存在的一定串扰。

“Sedat”配置

该配置使用装配在同步滤光片转轮中的多个单波段激发片、多个单波段发射片，和一个具有多边缘的二向色镜分光镜。该方法为高速同时彩色成像提供了很好的图像保真度，但需要在系统硬件上加大投入。

Semrock可同时提供“全多带”四波段滤光片组和独特的四色“Pinkel”和“Sedat”组。

像素位移

当成像路径中的滤光片（荧光显微镜中的发射片和/或二向色镜分束镜）具有非零度的楔形角时，会产生像素位移。

像素位移会导致光线偏离，使在高分辨率CCD相机上检测到的图像发生偏移。当多色荧光图像叠加时（为了同时从多个荧光染料中观察荧光），大家会重叠不同滤光片组获得的同一物体的两个或多个图像，如果滤光片存在任何显著的非零度的楔形角，就会导致图像不能注册（或成像）到CCD相机上的相同像素。因此，不同荧光染料产生的图像将无法准确地关联或组合。

图像配准度差，或像素位移，几乎都是不可避免的非零度的滤光片楔形角导致的结果。降低像素位移对于获得更好效果至关重要。尤其对于需要转换滤光片，且多次曝光的测量，像素位移会导致成像性能变差。

Semrock的离子束溅射镀膜工艺使所有BrightLine滤光片都可以由一块玻璃独特地构成，永久性的硬膜直接镀在基材的外部。这项低损耗和高可靠性的结构固有地提供了优越的成像性能，BrightLine–ZERO滤光片组基板的制造和严格测试达到了认证的“零像素位移”性能的公差。

对于较旧的软镀膜滤光片，该类型产品必须使用多个基材，通常用粘合剂粘在一起，会导致明显的楔形角，因此导致了像素位移。为了改善成像配准，需要额外的处理、对准步骤和补偿光学器件，从而增加成本。相比之下，BrightLine-Zero滤光片组具有固有的可制造性，价格适中。

关键词：荧光染料箭头方向更加容易

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